猪圆环病毒病2型诊断技术的研究进展

   日期:2017-08-12 12:12:59   来源:猪价格网    热度:   ©内容举报

  猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)是1974年德国学者Tischer从PK15细胞中发现的一种不产生细胞病变的污染病毒,开始一直未被重视,所以在猪群中广泛传播。直到1982年Tischer等通过实验分离鉴定了该病毒后将其命名为猪圆环病毒,PCV隶属于圆环病毒科、圆环病毒属,基因组为单股单股负链闭合环状DNA病毒。病毒粒子直径为14~25 nm,为二十面体对称结构,无囊膜,是迄今为止发现的一种最小的脊椎动物病毒。根据其致病性、抗原性以及核酸序列的不同,将其分为无致病性的PCV-1型和致病性的PCV2型。两种基因型的基因组序列长度不一样,前者为1 759 bp,后者为1 767 bp或1 768 bp。现在许多国家的猪圆环病毒感染都是PCV2感染。PCV2在临床上主要与断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)、仔猪先天性震颤(CT)、坏死性间质性肺炎(PNP)、母猪繁殖障碍等疾病有关。此外,PCV2还侵害机体的免疫系统,增加其他病毒和细菌感染的几率,从而导致猪群的死亡率增加。近年来PMWS在我国猪群中呈流行趋势,造成了很大的经济损失。由于猪群中普遍存在PCV抗体,血清学诊断结果并不准确可靠,所以本病的诊断工作一般都在病猪死亡后进行。同时,PMWS的症状和病变与猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)基本相似,所以仅凭症状、病理变化及流行病学调查很难做出准确的判断。目前,对PCV2的诊断主要是先通过临床症状结合病理变化进行初步判定,再结合实验室检验来确诊。本文将主要对PCV2的实验室诊断方法进行综述,以便为临床上猪圆环病毒病2型的确诊提供依据。现将猪圆环病毒病2型诊断技术综述如下。

  1 病原学诊断

  1.1 病毒的分离鉴定

  采集PMWS病死猪肺、肝、脾、扁桃体及淋巴结等组织研磨制成病料与PBS液体积比为1:5的悬液,在-20 ℃反复冻融3次后12 000 r/min离心20 min,取上清液用220 nm滤器过滤后接种于已长成单层且无PCV污染的PK-15细胞,37 ℃吸附1 h(期间每15 min轻摇一次),然后加入5 mL含2%胎牛血清的MEM/DMEM细胞维持液,37℃培养24 h后倒掉细胞培养液,用300 mmol/L D-氨基葡萄糖处理后用pH为7.4的10 mmol/L无菌PBS洗涤2次,然后加入5 mL含2%胎牛血清的MEM/DMEM细胞维持液,37 ℃培养48~72 h后传代培养,12 h后用300 mmol/L D-氨基葡萄糖溶液处理30 min,弃去D-氨基葡萄糖用pH为7.4的10 mmol/L无菌PBS洗涤2次,然后加入10%胎牛血清的MEM细胞营养液培养,因为PCV2接种细胞后不产生细胞病变(CPE),需连续盲传1-3代后进行PCV2抗原或核酸的检测加以鉴定,也可用免疫荧光技术(IFA)检测病毒的生长情况,或者借助电镜技术和超薄切片法来观察PCV病毒粒子。本方法费时费力,不适于临床上疾病的快速诊断。

  在我国,郎洪武等用猪肾传代细胞Dulac株分离到了2株猪圆环病毒。汤德元等将贵州分离到的猪圆环病毒提取的DNA通过PCR技术扩增PCV ORF2基因,克隆到pMD19-T载体并测序,后将构建好的T载体双酶切,然后将回收的目的片段与pET-32a(+)载体及pcDNA3.1(+)载体连接并转化入感受态细胞TOP10中构建原核及真核表达载体,并将ORF2基因插到重组质粒pcDNA3.1-IL-2上,构建以IL-2融合表达真核载体。结果表明:克隆的PCV ORF2基因全长为719 bp,ORF为702 bp,编码233个氨基酸,与GenBank公布的PCV ORF2基因的核苷酸同源性为98.4%。国内很多研究人员分别从各地的病猪上分离到了多株猪圆环病毒。

  1.2 电镜观察法

  利用电镜技术将感染猪淋巴或病毒细胞培养物制成切片在电镜下观察,则可从平面上观察到病毒的内部结构,形态大小,复制方式等,再结合病毒自身所具有的形态、大小及结构等不同特征即可对观察到的病毒做出准确的判断。

  G W Steveson等在透射电镜下观察感染PCV2的PK-15细胞,将细胞病毒液反复冻融3次,8 000 r/min离心30 min后弃沉淀再将上清液40 000 r/min超速离心3 h,弃掉上清液,用0.01 mol/L pH 8.0的TE缓冲液重悬沉淀并收集,通过透射电镜观察到了PCV2,并首次详细描述了细胞的胞浆与细胞核内的病毒包涵体及病毒粒子的形态。

  2 血清学检测

  2.1 酶联免疫吸附试验

  酶联免疫吸附试验(ELISA)是将抗原或抗体吸附于固相载体,在载体上进行免疫酶染色,底物显色后用肉眼或酶标仪测定结果的一种方法。这种方法特异性高、敏感性强、检测速度快、可一次检测大批量的样品,既可以检测抗原,又可以检测抗体,是目前应用最多最广也是发展最快的检测方法。

  2000年,郎洪武等用加拿大的PCV2克隆化特异性表达抗原、阳性血清、阴性血清,按照常规方法进行PMWS抗体的检测,将被检血清按1:400稀释,阳性和阴性对照血清按1:100稀释,当被检样品的OD值是阳性对照OD值的3倍时判为阳性,否则为阴性,此方法证明ELISA的灵敏度比较高。

  2.2 竞争性酶联免疫吸附试验

  2000年,Walker等首次利用PCV1和PCV2特异性单克隆抗体建立了竞争ELISA(C-ELISA)方法来检测PCV2抗体。利用细胞培养的PCV2作为抗原,PCV2特异性单克隆抗体作为竞争试剂,成功建立了C-ELISA,将此法与间接免疫荧光方法相比较,结果表明C-ELISA方法的检出率为99.58%,高于间接免疫荧光方法的97.14%,证明此方法与间接免疫荧光相比更加敏感,可用于PCV抗体的大规模监测。

  2.3 间接免疫荧光试验

  间接免疫荧光技术(IFA)是一种比较特异的血清学方法,主要用于病毒分离效果的鉴定及监测病变组织或猪源细胞PCV的感染情况,其特点是快速、特异、敏感、花费少,既可以检测猪群特异性抗原又可以检测特异性抗原,应用较广泛。

  2004年,Racine S等将PCV2 IAF-2897株的ORF2克隆入真核表达载体pCEP5中,并获得了大量的表达,他们用IFA技术对PMWS猪场的44份血清样品进行了检测,结果15份为PCV2阳性,检出率为57.1%。2002年,我国的芦银华等也应用间接荧光技术对几个地区的64份临床血样进行了检测,结果38份血清呈现PCV抗体阳性(59%),这表明PCV已在我国普遍流行。

  2.4 抗原捕获ELISA

  Mcneilly F等建立了抗原捕获ELISA方法用来诊断PMWS。在与病毒分离、IHC和聚合酶链式反应技术(PCR)等方法的比较中,除PCR外,其他方法均可鉴别PWMS与PCV2的亚临床感染。

  周松海将纯化得到的高纯度单克隆抗体包被在96孔酶标板上,0.5% BSA封闭后加入到Cap蛋白中,Cap蛋白与包被的抗体发生特异性反应也结合在酶标板上,可以用来检测血清中的PCV2抗体。对反应条件进行摸索优化,确定包被抗体的最佳稀释度为1∶3 200,与之结合的Cap蛋白最佳稀释度为1∶2 000(即浓为3.52 μg/mL),被检血清最佳稀释度为1∶40,鼠抗猪酶标二抗最佳稀释度为1∶16 000,以此建立的捕获ELISA方法的临界值为0.2,即若血清样品OD630nm值大于0.2则判为阳性,反之则判为阴性。对建立的捕获ELISA方法进行敏感性、特异性和重复性研究,确定此方法具有良好的敏感性、特异性和重复性。

  2.5 免疫胶体金技术

  免疫胶体金技术(ICGT)的原理是用红色胶体金为标记物,以微孔滤膜为载体,通过渗滤而逐步反应,3~5 min便可完成整个反应。王慧杰等通过克隆和表达猪圆环病毒Cap蛋白基因的羧基端,结合胶体金标记技术,建立了PCV2 Cap抗体胶体金检测方法。用ELISA验证结果显示表达蛋白免疫原性较强且能准确地区分PCV2的阳性血清和标准阴性血清,与猪其他病毒免疫血清无交叉反应,其检测灵敏度与ELISA相似。

  2.6 免疫过氧化物酶单层细胞试验

  免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)方法基本原理是将生长有PCV的PK-15细胞在96孔板上长成单层后,加入10倍稀释的待检猪血清,作用一段时间后吸干(或拍干)洗涤,再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的猪IgG抗体,37 ℃孵育30 min,吸干(或拍干)洗涤后加入底物溶液显色,然后终止反应以检测血清中的抗体。黄立平等建立了一种检测PCV-1血清抗体的IPMA方法。利用该方法对257份血清样品进行检测,结果显示,PCV1和PCV2阳性率分别为19.1%和80.5%,且PCV1阳性血清中有95.9%为PCV2阳性,表明临床上PCV1与PCV2在猪群中混合感染程度高。刘长明等将IPMA方法改进后,研制出一种新的IPMA抗体检测试剂盒,适用于猪血清中PCV2抗体检测,且该方法具有特异性强、敏感性高、操作简便等优点。

 
 
 
相关资讯
 
相关图文
 
图文热点
 

 
相关栏目
今日价格
  • 生猪报价 (今日)
  • 大盘价格 (今日)
  • 玉米价格 (今日)
  • 仔猪价格 (今日)
  • 豆粕价格 (今日)
  • 猪肉价格 (今日)
  • 养猪宝箱
  • 分娩计算 (精品)
  • 仔猪免疫 (好用)
  • 母猪免疫 (推荐)
  • 药物配伍 (推荐)
  • 收猪经纪人 (推荐)
  • 中介信息 (推荐)
  • 卖猪信息 (推荐)
  • 微信查猪价 (推荐)
  • 养猪QQ群 (各地)
  • 为您推荐

    精彩推荐

    各地普遍供需两低!5月21日全国生猪报价

    各地普遍供需两低!5月21日全国生猪报价

    牛X!这个猪场7个人能养25000头猪,成本仅要5.8元/斤

    牛X!这个猪场7个人能养25000头猪,成本仅要5.8元/斤

    干货:蓝耳病的流行动态、防控建议、驯化实践案例……

    干货:蓝耳病的流行动态、防控建议、驯化实践案例……

    决战脱霉剂使用乱象!嘉吉利用大数据让你的成本降到更低!

    决战脱霉剂使用乱象!嘉吉利用大数据让你的成本降到更低!

    老公:你可以不爱我,但一定要爱咱们的猪……

    老公:你可以不爱我,但一定要爱咱们的猪……

    功能性大豆膳食纤维

    功能性大豆膳食纤维

    为什么有的母猪产程过长 原因何在

    为什么有的母猪产程过长 原因何在

    配种舍的光照设置

    配种舍的光照设置

    青霉素是养猪场常用药,想用好,你得了解这9点

    青霉素是养猪场常用药,想用好,你得了解这9点

    西瓜皮能治疗这8种猪病,看完你肯定舍不得扔它!

    西瓜皮能治疗这8种猪病,看完你肯定舍不得扔它!

    仔猪杀手仔猪红痢:来源、症状、诊断、治疗

    仔猪杀手仔猪红痢:来源、症状、诊断、治疗

    天气炎热,母猪热应激的紧急处理措施

    天气炎热,母猪热应激的紧急处理措施

     
    网站首页 | 关于我们 | 投稿指南 | 联系方式 | 使用协议 | 版权隐私 | 网站地图 | 辽ICP备11016505号-2